Prírodné pomery Prešovského kraja sú veľmi pestré. Povrch druhého najrozľahlejšieho kraja na Slovensku je prevažne hornatý. Územie kraja pretína dôležitá hranica medzi Západnými a Východnými Karpatmi. K najznámejším geomorfologickým celkom patria Tatry, Pieniny, Spišská Magura, Levočské vrchy, Čergov, Šarišská vrchovina, Košická kotlina, Slanské vrchy Ondavská vrchovina, Laborecká vrchovina, Bukovské vrchy a Vihorlatské vrchy.
Región Prešovského kraja patrí z hľadiska prírodnej hodnoty k najvzácnejším na Slovensku. Nachádzajú sa tu najstarší národný park na Slovensku (1949) Tatranský národný park (TANAP), ktorý je od roku 1993 aj biosférickou rezerváciou, najstarší medzinárodný prírodný park v Európe Pieninský národný park (PIENAP) a Národný park Poloniny, ktorého pralesy sú zapísané do zoznamu svetového dedičstva UNESCO. Do Prešovského kraja ďalej zasahujú Národný park Nízke Tatry (NAPANT) a Národný park Slovenský raj so svojím špecifickým územím roklín a tiesňav. Bohatými lesmi sa vyznačuje Chránená krajinná oblasť Východné Karpaty a na rastliny a živočíchy vzácna Chránená krajinná oblasť Vihorlat. Okrem plošne rozsiahlych chránených území sa v Prešovskom kraji nachádza aj niekoľko desiatok maloplošne chránených území – národné prírodné rezervácie, prírodné rezervácie, národné prírodné pamiatky, prírodné pamiatky, chránené areály.
Najvyšším miestom Prešovského kraja je Gerlachovský štít (2655 m n. m.) vo Vysokých Tatrách, ktorý je zároveň aj najvyšším vrchom Slovenskej republiky. Najnižšie položené miesto sa nachádza pri výtoku rieky Ondavy z kraja v katastri obce Nižný Hrušov (105 m n. m.).
Prešovský kraj má najchladnejšie a najdaždivejšie podnebie na Slovensku. Z hydrografického hľadiska patrí Prešovský kraj k úmoriu Baltského a Čierneho mora. Územím prechádza hlavné európske rozvodie. Najvýznamnejšími vodnými tokmi sú Torysa, Topľa, Ondava, Laborec, Cirocha a v západnej časti kraja Poprad a Dunajec. Z prírodných jazier je veľká väčšina sústredená vo vysokohorskom prostredí Vysokých Tatier (plesá). Nachádza sa tu najväčšie aj najhlbšie pleso v slovenských Tatrách – Veľké Hincovo pleso (20,08 ha, 53 m), ako aj najvyššie položené Modré pleso (2192 m n. m). Sú tu aj najvyššie vodopády Slovenska s dominujúcim 80 metrov vysokým Kmeťovým vodopádom v doline Nefcerka.
Veľký význam majú vodné nádrže – Veľká Domaša na Ondave a Starina na Ciroche. Z minerálnych vôd sú najznámejšie kyselky vo Vyšných Ružbachoch, Novej Ľubovni, Bardejovských Kúpeľoch, Cigeľke, Sivej Brade, Baldovciach, Gánovciach, Lipovciach a Šindliari. V Bardejovských Kúpeľoch, Vyšných Ružbachoch a v Novej Ľubovni vznikli už v minulosti významné kúpeľné centrá.
Pôvodná vegetácia Prešovského kraja bola tvorená prevažne lesmi. Dominantnými druhmi sú duby, buky, smreky, smrekovce, jedle a borovice. Veľmi vzácna a pestrá je aj fauna Prešovského kraja. Medveď hnedý, vlk obyčajný, rys ostrovid, kamzík vrchovský stredoeurópsky, svišť vrchovský tatranský a mnoho ďalších druhov sú typickými živočíšnymi zástupcami oblasti.