Najstarším dokladom osídlenia Prešovského kraja je vzácny antropologický nález výliatku mozgovne neandertálskeho pračloveka z Gánoviec pri Poprade z doby 120 000 rokov pred naším letopočtom. Ďalšie sídliská dokumentujúce hustotu osídlenia oblasti sa nachádzali v Popradskej a Hornádskej kotline, v Šarišskej a Ondavskej vrchovine, v Košickej kotline a v podhorí Vihorlatu.
Územie zasiahla bukovohorská, bádenská, koštianska, otomanská a lužická kultúra a v neskoršej dobe keltsko–dácka kultúra, ktorá sprostredkovala styk oblasti s vyspelými kultúrami Stredozemného mora. Od 6. storočia územie v niekoľkých časových etapách osídľujú Slovania. Kontinuita tohto osídlenia je doložená od veľkomoravského obdobia až do 12. storočia.
Súčasťou uhorského ranofeudálneho štátu sa územie stalo postupne v 11. – 13. storočí., kedy sa jeho hranice ustálili na hrebeni Karpát. V 12. storočí dochádza k stavbe kráľovských hradov (Spišský, Šarišský, Kapušiansky, Plaveč), ktoré vojensky ovládali pohraničie a krajinské cesty. V 13. storočí zasiahol územie ničivý vpád Tatárov. Panovník sem pozýva nemeckých hostí, predovšetkým zo Saska, ktorí osídľujú najmä región Spiša a zabezpečujú hospodársky rozkvet kraja. Územie sa postupne člení na stolice (Spišská, Šarišská, Zemplínska). Z obcí a trhových mestečiek vznikajú pridelenými privilégiami mestá, z ktorých najvýznamnejšími a najstaršími sa stali Bardejov, Kežmarok, Levoča, Prešov, Sabinov, Spišská Sobota, Veľký Šariš a ďalšie.
Cez tieto mestá viedli obchodné cesty z Balkánu cez Uhorsko a Poľsko do Pobaltia. Najznámejšou bola Magna via – veľká cesta (kopírovala známu „jantárovú cestu“) na osi Košice – Prešov – Bardejov. Rozvoj obchodu a remesiel sa odrazil v rozmachu miest, ktoré sa spojili do spolku piatich východoslovenských slobodných kráľovských miest Pentapolitany (Košice, Levoča, Bardejov, Prešov, Sabinov). Z tohto obdobia pochádza aj najviac architektonických skvostov. Ekonomická a kultúrna vyspelosť týchto miest je aj v stredoeurópskom kontexte vysoká.
15. storočie bolo v znamení vyostrenia bojov o uhorský trón, rozmachu bratríckeho hnutia a sociálnych nepokojov. Do zálohy poľskému kráľovi sa dostáva 13 spišských miest. V 16. storočí sa počas valaskej kolonizácie výrazne zvýšil podiel rusínskeho obyvateľstva na celkovej národnostnej štruktúre regiónu.
Južné časti Spiša a Šariša zasiahli v 16. storočí pustošivé nájazdy Turkov. Po ich porážke na konci 17. storočia zaznamenáva celý región intenzívnu stavebnú činnosť pri obnove miest a hradov. Vzniká tzv. východoslovenská renesancia (Levoča, Spišský Hrhov, Strážky, Fričovce). Územie intenzívne zasiahli protihabsburské stavovské povstania. Osobitne kruto povstanie kežmarského feudála Imricha Thökölyho („prešovské krvavé jatky“ v roku 1687) a povstanie Rákocziovcov (17. - 18. storočie).
Zlá ekonomická a sociálna situácia, úpadok remesiel a obchodu v mestách, živelné pohromy, epidémie a hladomory, vyvolali východoslovenské roľnícke povstanie v roku 1831, ktoré pripomína monumentálny pamätník na vrchu Furča nad Haniskou pri Prešove. Od polovice 19. storočia dochádza k masovému vysťahovalectvu obyvateľstva na Dolnú zem a neskôr do Zámoria. Do dejín regiónu zasiahli najväčšie svetové vojenské konflikty prvej polovice 20. storočia. Krvavé bitky medzi ruskými a rakúsko–uhorskými armádami na severovýchode územia počas prvej svetovej vojny vyvrcholili Karpatsko-duklianskou operáciou na sklonku druhej svetovej vojny v roku 1944, pri ktorej zahynulo na oboch stranách takmer 150 000 vojakov. Tieto udalosti pripomína 28 m vysoký kamenný pylón na cintoríne v Duklianskom priesmyku.